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抗猪IgM μ链特异性小鼠单克隆抗体的制备与应用研究

发布时间:2025-07-16 点击数:134

猪IgM作为机体早期免疫应答的重要标志物,其μ链的特异性检测在兽医诊断和免疫学研究领域具有重要意义。制备高特异性、高亲和力的抗猪IgM μ链单克隆抗体,可为猪病诊断、疫苗效价评估及免疫机制研究提供关键工具。近年来,单克隆抗体技术因其高度特异性和可重复性,已成为免疫检测领域的重要支柱。本研究通过杂交瘤技术成功制备了抗猪IgM μ链的小鼠单克隆抗体,并系统评估了其在酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹(Western blot)中的应用效果。

在单克隆抗体制备过程中,首先采用纯化的猪IgM免疫BALB/c小鼠,通过脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合获得杂交瘤细胞。经过有限稀释法亚克隆筛选,最终获得3株能稳定分泌抗猪IgM μ链抗体的杂交瘤细胞株。间接ELISA检测显示,3株单抗的效价均达到1:10^5以上,其中2C7株亲和力最高(Kd=3.2×10^-9 M)。抗体亚类鉴定表明,2C7为IgG1/κ型,其轻链基因测序显示互补决定区(CDR)具有独特的氨基酸序列特征。

抗体特异性验证通过交叉反应实验完成。结果显示,2C7单抗仅与猪IgM μ链发生特异性结合,与猪IgG、IgA及牛、羊、鸡等异源IgM均无交叉反应。免疫印迹分析进一步证实,该抗体能特异性识别猪血清中约75kDa的μ链蛋白条带,与理论分子量相符。空间表位分析表明,2C7单抗识别位点位于μ链Cμ3功能区的构象依赖性表位,该特性使其在天然构象蛋白检测中具有显著优势。

在应用性能评估方面,2C7单抗成功建立了检测猪血清IgM的双抗体夹心ELISA方法。该方法线性范围为15.6-1000 ng/mL,最低检测限达7.8 ng/mL,批内和批间变异系数分别小于5%和8%。与商品化多克隆抗体相比,单抗检测体系显示出更好的批间一致性和稳定性。在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染模型的动态监测中,该检测系统能准确反映感染后7-14天IgM抗体的显著升高,为早期感染诊断提供了可靠依据。

此外,该单抗在免疫组化中的应用表现出良好的组织穿透性,能清晰标记猪淋巴结生发中心的IgM+ B细胞。流式细胞术分析显示,2C7单抗可特异性识别外周血中表面IgM阳性的B淋巴细胞,且非特异性结合率低于2%。这些特性使其成为研究猪B细胞发育和体液免疫应答的有力工具。值得注意的是,单抗的冻干制剂在4℃保存12个月后仍保持90%以上的活性,显著优于传统多抗的稳定性。

综上所述,抗猪IgM μ链特异性单克隆抗体2C7具有高亲和力、高特异性和良好的稳定性,在猪病诊断和免疫学研究领域展现出广阔的应用前景。该抗体的成功制备不仅填补了猪特异性免疫检测试剂的空白,其独特的表位识别特性也为猪IgM结构与功能研究提供了新的分子探针。未来研究可进一步探索该抗体在新型检测技术如量子点免疫层析和微流控芯片中的应用潜力。



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