胶体金制备与抗体标记
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胶体金合成（柠檬酸三钠还原法）
- 取100mL 0.01% HAuCl₄溶液置于锥形瓶中加热至沸腾
- 快速加入1.5mL 1%柠檬酸三钠溶液，持续搅拌
- 保持沸腾10分钟，溶液由淡黄变为酒红色
- 冷却至室温，4℃避光储存
质控标准： 粒径40±5nm（TEM验证），OD₅₂₀=0.8-1.2
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标记抗体优化（7G10抗体）
| 优化参数 | 测试范围 | 判定标准 |
|---|---|---|
| 标记pH值 | 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 | 最小聚集点（肉眼+紫外扫描） |
| 标记抗体量 | 5, 10, 15, 20μg/mL胶体金 | 盐稳定性试验（无变蓝） |
| 封闭条件 | 1% BSA，37℃ 15min | 离心后复溶无沉淀 |
注意： 标记后金标抗体需4℃避光保存，使用前离心（12,000g, 30min）
金标垫与NC膜制备
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金标垫处理
- 处理液配方： 0.02M Borate (pH 8.2) + 1% BSA + 0.5% Tween-20 + 5%蔗糖
- 玻璃纤维垫浸泡处理液30分钟
- 37℃干燥2小时
- 金标抗体喷涂浓度：0.5/1.0/1.5mg/mL梯度优化
- 喷量控制：8-10μL/cm（划膜仪校准）
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NC膜包被（划线工艺）
| 参数 | T线（4G3） | C线（羊抗鼠IgG） |
|---|---|---|
| 抗体浓度 | 0.5/1.0/1.5mg/mL梯度 | 1.0mg/mL |
| 缓冲液 | 0.01M PBS (pH7.4) | |
| 划线速度 | 1.0μL/cm | |
| 线间距 | T-C间距5mm，C线距底端8mm | |
- 封闭：0.5% Casein/PBS浸泡30min，37℃干燥
- 质控：划线宽度≤1.0mm（显微镜检测）
试纸条组装与性能验证
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试纸条组装
- 层压顺序（自上而下）： PVC底板 → NC膜 → 金标垫 → 样本垫 → 吸水垫
- 搭接参数：金标垫覆盖NC膜1.5mm，样本垫覆盖金标垫2.0mm
- 切割规格：3.8mm宽/条
- 湿度控制：环境湿度≤30% RH
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性能验证实验
灵敏度测试
- 抗原：重组ASFV p72蛋白梯度稀释（1000, 100, 10, 1, 0 ng/mL）
- 判定标准：最低可见T线浓度≥10ng/mL
特异性验证
| 干扰样本 | 预期结果 |
|---|---|
| 猪瘟病毒(CSFV) | T线阴性 |
| 猪流行性腹泻(PEDV) | T线阴性 |
| 健康猪血清 | T线阴性 |
加速稳定性
- 37℃放置7天（相当于6个月实时稳定性）
- 质控标准：灵敏度/特异性无显著变化（T线显色强度下降≤10%）